EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE FOSFODIESTERASE 4B HUMANA EM E. COLI

Gabriel de Lima Leal; Manuela Goulart Araujo; Natália Correa da Silva; Marcelo de Freitas Lima

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Trabalho

Título do Trabalho

EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE FOSFODIESTERASE 4B HUMANA EM E. COLI

Autores

Gabriel de Lima Leal
Manuela Goulart Araujo
Natália Correa da Silva
Marcelo de Freitas Lima

Modalidade

Resumo

Área temática

Multidisciplinar

Data de Publicação

22/04/2025

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/xi-raic-e-v-raidtec-ufrrj/933655-expressao-heterologa-de-fosfodiesterase-4b-humana-em-e-coli

ISBN

978-65-272-1295-9

Palavras-Chave

PDE4B, expressão heteróloga, biotecnologia

Resumo

As fosfodiesterases (PDE) são uma superfamília de enzimas, importantes no catabolismo da adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cAMP) e guanosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cGMP), hidrolisando-as em adenosina 5’-monofosfato (AMP) e guanosina 5’-monofosfato (GMP), respectivamente. A fosfodiesterase 4B (PDE4B) é uma isoenzima dessa superfamília e possui seletividade pelo cAMP. Além disso, regula os níveis intracelulares desse segundo mensageiro, desempenhando um papel importante na modulação da sinalização celular, como descrito nas respostas inflamatórias. Devido ao seu papel central na regulação da resposta inflamatória, a PDE4B tem sido estudada como um alvo terapêutico promissor para o tratamento de diversas doenças inflamatórias, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e doença de Alzheimer (DA). Atualmente, há uma demanda por novos inibidores para PDE4 (iPDE4), que apresentem menores efeitos adversos do que os disponíveis no mercado, os quais estão comumente associados à ocorrência de náusea, êmese e cefaleia. Dessa forma, a produção de enzimas recombinantes auxilia na triagem de novos iPDE4 e permite a disponibilidade de isoformas específicas para ensaios de inibição. Neste estudo, buscou-se a expressão heteróloga da isoforma PDE4B1 humana em Escherichia coli (E. coli) cepa BL21 (DE3), visando uma metodologia para a produção dessa enzima na forma ativa. A expressão heteróloga foi realizada utilizando o vetor pET26b(+), no qual o gene HsPDE4B foi clonado. Para otimizar a produção da PDE4B1 recombinante, diferentes condições de indução foram testadas, incluindo variações na concentração do indutor (isopropil ß-D-1-tiogalactopiranosideo - IPTG), temperatura de incubação e composição do meio de cultivo Luria-Bertani (LB). Os resultados indicaram um nível satisfatório de expressão da PDE4B1 tanto a 18°C quanto a 30°C por 16h e 4h, respectivamente, utilizando 1,0 mM de IPTG. A concentração de IPTG também foi avaliada em diferentes composições de meio LB para verificar a influência do indutor na expressão. Dessa forma, a condição de expressão mais eficiente foi 30°C por 4h, utilizando 0,25 mM de IPTG em meio LB contendo triptona 1%, NaCl 1% e extrato de levedura 0,5%. A eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE) 8% demonstrou a presença da proteína recombinante de ± 83,5 kDa, compatível com a massa teórica. Dessa forma, a otimização do protocolo de expressão resultou em um sistema de produção de proteína recombinante promissor, no qual cada iPDE4 poderá ser avaliado. Além disso, o êxito na expressão da PDE4B1 em E. coli possibilita futuras adaptações no protocolo, visando o aumento da produção da enzima recombinante com intuito de melhorar o rendimento. Portanto, a triagem de novos inibidores, utilizando uma enzima produzida in-house, diminuirá a dependência desse insumo importado, sem disponibilidade imediata e de alto valor agregado.

Título do Evento: XI Reunião Anual de Iniciação Científica da UFRRJ (RAIC 2024) & V Reunião Anual de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (RAIDTec 2024)
Cidade do Evento: Seropédica
Título dos Anais do Evento: Anais da XI Reunião Anual de Iniciação Científica da UFRRJ (RAIC) e V Reunião Anual de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (RAIDTec): Transição energética: impactos ambientais e sociais
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

LEAL, Gabriel de Lima et al.. EXPRESSÃO HETERÓLOGA DE FOSFODIESTERASE 4B HUMANA EM E. COLI.. In: Anais da XI Reunião Anual de Iniciação Científica da UFRRJ (RAIC) e V Reunião Anual de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação (RAIDTec): Transição energética: impactos ambientais e sociais. Anais...Seropédica(RJ) UFRRJ, 2024. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/xi-raic-e-v-raidtec-ufrrj/933655-EXPRESSAO-HETEROLOGA-DE-FOSFODIESTERASE-4B-HUMANA-EM-E-COLI. Acesso em: 10/07/2025