PRODUÇÃO DE LISADO DE PLAQUETAS HUMANAS A PARTIR HEMOCOMPONENTES, COM A VALIDADE DE USO CLÍNICO EXPIRADA, PARA USO EM CULTIVO DE CÉLULAS HUMANAS IN VITRO.

Edson Guilherme Eiterer De Andrade; Raphaela Mendes Dantas; Rebeca Andrade Alves; Marcus Vinicius Telles Teixeira; Esther Rieko Takamori; Radovan Borojevic

Título do Trabalho

Autores

Edson Guilherme Eiterer De Andrade
Raphaela Mendes Dantas
Rebeca Andrade Alves
Marcus Vinicius Telles Teixeira
Esther Rieko Takamori
Radovan Borojevic

Modalidade

Trabalhos Científicos

Área temática

Exemplo de Área Temática

Data de Publicação

18/12/2020

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/scunifasefmp/281578-producao-de-lisado-de-plaquetas-humanas-a-partir-hemocomponentes-com-a-validade-de-uso-clinico-expirada-para-us

ISSN

2675-8563

Palavras-Chave

plaquetas; cultura de células; PRP; Hemocomponentes; lisado de plaquetas

Resumo

Introdução: Os Hemocentros produzem diversos produtos fracionados do sangue a partir de uma única doação. Dentre eles, o Concentrado de Plaquetas (CP), que contem cerca 10^6 plaquetas/µL em aproximadamente 60 mL de plasma, sendo destinado para uso em terapia transfusional. Devido à natureza do material, a validade de uso clínica das unidades de CP é de apenas 5 dias, sendo descartados em seguida. As plaquetas humanas, quanto ativadas por processos de coagulação, liberam de seus grânulos internos uma pletora de fatores estimulatórios e regulatórios que atuam sobre várias atividades de células humanas, de grande interesse em Medicina Regenerativa. Neste contexto, os fatores biológicos plaquetários, potencialmente liberados dos CPs com prazo de validade expirado para uso transfusional, podem ser aproveitados na cultura e expansão de células in vitro, como suplemento mitogênico, ou como indutores da diferenciação celular. Para a manipulação e preparo de células destinadas ao uso clínico em medicina regenerativa, eles podem substituir o uso tradicional dos produtos de origem animal, como o soro fetal bovino, que podem introduzir partículas virais ou moléculas pro-inflamatórias de origem animal, causando potencialmente um grande perigo aos pacientes. Objetivos: Avaliar a eficiência do processo de lise das plaquetas durante os 3 ciclos de congelamento/descongelamento de 05 amostras de CP, para assim estabelecer protocolo preparação de um lote Lisado de Plaquetas humano (hLP). Material e Métodos: Cinco unidades de CP randômicas, de sorologia negativa, de prazo de validade expirado para uso transfusional, foram cedidas pelo Banco de Sangue Santa Teresa e encaminhadas ao laboratório NBII do Centro de Medicina Regenerativa da UNIFASE, Petrópolis - RJ. (Registro CEP/ CONEP para uso de material biológico: CONEP n° 2.010.402. CAAE: 58129216.6.0000.5245). As amostras foram submetidas a 03 ciclos de congelamento a -80ºC e aquecimento rápido a 37ºC com o intuito de romper as membranas das plaquetas (lise) e liberar seus fatores no plasma. A cada ciclo, amostras do plasma foram quantificadas em contador hematológico BC-2500 Mindray, acompanhando a eficiência do processo de lise plaquetária. Cada quantificação foi feita em triplicata e os resultados compilados em planilhas para estabelecer a média, desvio padrão e gráficos. Ao final do processo, o plasma das 5 amostras foi acondicionado em um único lote, com adição de 20 mM de CaCl2, a fim de depletar o fibrinogênio. O lote foi centrifugado para espremer o coágulo e extrair o sobrenadante com os fatores regenerativos. Na última etapa, o lote foi filtrado em membrana esterilizante de 0,22 µm. Resultados e discussão: As amostras de CPs (n=5) continham em média 980 x 10^3 (±34) plt/µL. Após do primeiro ciclo, as amostras passaram a ter em média 1145 x 10^3 (±39) plt/µL, decaindo para 920 x 10^3 (±30) plt/µL, e para 720 x 10^3 (±27) plt/µL ao fim do 3º ciclo. Verificamos um comportamento inesperado ao longo dos ciclos, onde houve um aumento do número médio de plaquetas e que após decaem progressivamente. Isto pode ser explicado pela lise de parte das plaquetas ter gerado muitos artefatos de membrana, interpretados pelo contador hematológico como mais plaquetas. A lógica do processo de lise é que as plaquetas absorvam água, e os cristais de gelo formados com processo de congelamento no seu interior rompem as membranas plasmáticas e liberem o conteúdo de seus grânulos no descongelamento. O volume médio inicial das plaquetas era de 8,0 fentolitros (fL). Após o primeiro ciclo o volume médio das plaquetas em 9,8 fL, em seguida para 9,0 fL e ao final para 8,8 fL. O volume médio das plaquetas aumenta no primeiro ciclo e decaindo em seguida, indicando que as plaquetas absorvem água, mas que progressivamente perdem seu conteúdo Após a adição de CaCl2, o coágulo se formou em cerca de 20 minutos a 37ºC, englobando os restos plaquetários e corpúsculos celulares da amostra. Depois centrifugados, o sobrenadante com os fatores plaquetários foi colhido (hLP) e o coágulo é descartado. No hLP final não foram detectadas plaquetas, eritrócitos ou leucócitos na amostra de plasma. De um volume inicial de 320 mL de plasma e plaquetas, o rendimento final do lote após a filtração foi de 210 mL de hLP. Na literatura científica, pratica-se o processo de lise entre 2 e 3 ciclos, pois a cada congelamento pode-se prejudicar os fatores de interesse. Apesar do número das plaquetas não se reduzir abaixo de 70% do inicial, isso não significa que não houve liberação de fatores, pois o contador hematológico não pode distinguir entre plaquetas íntegras e lisadas. Em todas as amostras individuais, o plasma foi se tornando mais turvo a cada ciclo, o que corrobora o aumento dos artefatos plaquetários rompidos. O lote de hLP obteve um rendimento de 65% do volume inicial, sendo suficiente para suplementação de aproximadamente 10 cultivos celulares por 2 meses cada. Conclusão: O processo de análise por congelamento/descongelamento foi eficiente em reduzir o número de plaquetas, e há indícios de que as plaquetas remanescentes foram lizadas ao fim do 3º ciclo. Entretanto, fazem-se necessários novos ensaios para dosar a quantidade de fatores liberados no lote e avaliar a atividade biológica do hLP sobre a dinâmica proliferativa das células in vitro.

Título do Evento: XXVI Semana Científica UNIFASE/FMP
Título dos Anais do Evento: Anais da Semana Científica
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

ANDRADE, Edson Guilherme Eiterer De et al.. PRODUÇÃO DE LISADO DE PLAQUETAS HUMANAS A PARTIR HEMOCOMPONENTES, COM A VALIDADE DE USO CLÍNICO EXPIRADA, PARA USO EM CULTIVO DE CÉLULAS HUMANAS IN VITRO... In: Anais da Semana Científica. Anais...Petrópolis(RJ) Centro Universitário Arthur Sá Earp Neto, 2020. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/SCUNIFASEFMP/281578-PRODUCAO-DE-LISADO-DE-PLAQUETAS-HUMANAS-A-PARTIR-HEMOCOMPONENTES-COM-A-VALIDADE-DE-USO-CLINICO-EXPIRADA-PARA-US. Acesso em: 07/05/2025