QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE PROTEÍNAS FUSIONADAS À GFP VIA PROTEÔMICA ALVO DIRECIONADA.

Isabela Monteiro dos Santos; Renata Maria dos Santos; Aline de Araújo Brasil; Fábio César Sousa Nogueira; Eliscael; Magno Junqueira

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Trabalho

Título do Trabalho

QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE PROTEÍNAS FUSIONADAS À GFP VIA PROTEÔMICA ALVO DIRECIONADA.

Autores

Isabela Monteiro dos Santos
Renata Maria dos Santos
Aline de Araújo Brasil
Fábio César Sousa Nogueira
Eliscael
Magno Junqueira

Modalidade

Resumo apresentação oral curta

Área temática

Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza (CCMN)/Bioquímica

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/317537-quantificacao-absoluta-de-proteinas-fusionadas-a-gfp-via-proteomica-alvo-direcionada

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

GFP, quantificação absoluta, proteômica alvo-direcionada, espectrometria de massa.

Resumo

A quantificação absoluta de proteínas em células, fluidos e secretados permite interpretar fenômenos biológicos de maneira precisa e reprodutível. A proteína verde fluorescente (GFP - Green Fluorescente Protein) é amplamente utilizada em biologia celular e bioquímica como uma molécula repórter para estudar a expressão gênica, tráfego e localização de proteínas, interações proteína-proteína e transdução de sinais. Os métodos atuais de quantificação de proteínas fusionadas à GFP restringem-se à quantificação da intensidade de fluorescência por microscopia ou detecção usando anticorpos por western blotting. Entretanto, esses métodos são semiquantitativos, o que compromete a comparação entre ensaios e a reprodutibilidade dos experimentos. Sendo assim, propomos, neste projeto, uma estratégia baseada em proteômica alvo direcionada para a quantificação absoluta de GFP e, consequentemente, proteínas fusionadas a ela em diferentes modelos biológicos. A partir desse método, será possível inferir a quantidade absoluta (cópias por célula) da proteína fusionada à GFP e acompanhar sua variação de acordo com o contexto biológico (Ex., tratamento com drogas, diferentes meios de cultivo, interações hospedeiro patógeno, choque térmico, tratamento com radiação, dentre outros). Para quantificação absoluta de GFP, foi proposto o método de proteômica alvo direcionada utilizando-se as técnicas de Selected Reaction Monitoring (SRM) e Parallel Reaction Monitoring (PRM). Peptídeos de GFP marcados isotopicamente com carbono 13 e/ou nitrogênio 15 foram utilizados para a criação de uma curva padrão de calibração por LC-MS/MS para a quantificação absoluta das formas endógenas das proteínas fusionadas a GFP. A proteína HSP-104 foi utilizada como modelo para a quantificação absoluta em cepa de S. cerevisiae expressando, com promotor endógeno, a proteína HSP-104 fusionada à GFP. Para tal, submetemos a cepa de S. cerevisae ao choque térmico e, consequentemente, a cinética de aumento da expressão de HSP-104 Com as curvas padrões obtidas a partir dos peptídeos sintéticos isotopicamente marcados, o limite de detecção determinado para o método foi de 6.8 fmol. As amostras de S. cerevisae submetidas a choque térmico por 1h a 40 \degc para induzir a expressão de HSP-104-GFP foram analisadas tanto por microscopia de fluorescência como por proteômica alvo direcionada. No momento, estamos determinando a sensibilidade e acurácia do método proposto de forma comparativa com os métodos de Western blotting e microscopia de fluorescência em relação à sensibilidade, acurácia e custo. Com este trabalho, pretendemos desenvolver uma metodologia barata, sensível e reprodutível para quantificação absoluta de proteínas contendo tag de GFP em diferentes proteomas. Finalmente, propomos a utilização desta nova técnica de quantificação absoluta de proteínas fusionadas à GFP como alternativa para responder questões biológicas que envolvam a dinâmica de síntese e degradação de proteínas em modelos biológicos.

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

SANTOS, Isabela Monteiro dos et al.. QUANTIFICAÇÃO ABSOLUTA DE PROTEÍNAS FUSIONADAS À GFP VIA PROTEÔMICA ALVO DIRECIONADA... In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/317537-QUANTIFICACAO-ABSOLUTA-DE-PROTEINAS-FUSIONADAS-A-GFP-VIA-PROTEOMICA-ALVO-DIRECIONADA. Acesso em: 02/08/2025