VALIDAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE NA MICROALGA CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

Giovanni Ferreira Montovaneli; GUILHERME HENRIQUE BITTENCOURT; SILAS PESSINI RODRIGUES

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Trabalho

Título do Trabalho

VALIDAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE NA MICROALGA CHLAMYDOMONAS REINHARDTII

Autores

Giovanni Ferreira Montovaneli
GUILHERME HENRIQUE BITTENCOURT
SILAS PESSINI RODRIGUES

Modalidade

Resumo apresentação oral padrão

Área temática

Campus Duque de Caxias/Biotecnologia

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/317229-validacao-da-composicao-de-vetor-de-expressao-de-proteina-recombinante-na-microalga-chlamydomonas-reinhardtii

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

microalgas, transformação, vetor, validação

Resumo

As microalgas Chlamydomonas reinhardtii são organismos modelo que emergiram como potencial plataforma para a produção em larga escala de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico e industrial. Um sistema baseado em Chlamydomonas apresenta-se como uma alternativa que, aliada ao baixo custo quando comparado à manutenção de células de mamíferos, é reconhecida como segura (GRAS), capaz de enovelar e montar proteínas complexas (Harris et al., 2009). Nesse contexto, o presente estudo visa estabelecer uma metodologia escalonável de modificação gênica no cloroplasto de C. reinhardtii, a fim de produzir proteínas estratégicas para o Sistema Único de Saúde do Brasil (SUS). Neste estudo foi escolhido como modelo a enzima L-Asparaginase (L-Asp), utilizada no tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda. Para tanto, o vetor de transformação foi desenhado contendo gene codificante da proteína de interesse, sob controle de regiões promotoras e 5’ e 3’UTR de genes endógenos, com elevado grau de transcrição e marcador de seleção. O constructo foi sintetizado pela empresa GeneScript e subclonado em vetor de expressão específico. Este estudo teve como objetivo validar a composição do vetor de expressão. Assim, experimentos de PCR e tratamento com enzimas de restrição foram conduzidos para verificar a síntese correta do vetor. Foi necessário montar os primers que flanqueiam a área do inserto de DNA no vetor, com a finalidade de identificar fragmentos de DNA amplificado de 300 pb (pares de base), para o vetor sem o inserto, ou 1200 pb, para vetor com o inserto. Após a síntese dos primers de PCR, os experimentos foram padronizados. Após diversas modificações no protocolo do PCR, as amplificações utilizando-se amostras controle positivo (vetor com inserto) e negativo (vetor sem inserto), foram observados diversos fragmentos amplificados, que não eram consistentes com os tamanhos esperados. Em paralelo, foram determinados os mapas de restrição de vetores vazios e cheios, com base no mapa vetorial original, utilizando-se as enzimas EcoRI e BamHI. Para o vetor vazio, que não continha o gene da L-Asp, dois fragmentos eram esperados, um de 3,596 pb e outro de 3,337 pb. Eles foram observados após a digestão simultânea com EcoRI e BamHI. Já para o vetor cheio, que continha o gene, eram esperados três fragmentos, de 3,596 pb, 3,337 pb e 2,008 pb. Entretanto, o fragmento de 3,337 pb não foi observado nesta amostra. Estes resultados sugerem a possível falta de uma parte do plasmídeo correspondente à uma das regiões do vetor, que são homólogas ao genoma do cloroplasto. A ausência da região no vetor justifica os resultados inconsistentes observados no PCR e impede a transformação eficiente do cloroplasto de C. reinhardtii. Um novo vetor já foi sintetizado em entrará em fase de teste após o retorno das atividades. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS HARRIS, E. H. et al. The Chlamydomonas Sourcebook: Volume 1:Introduction to Chlamydomonas and Its Laboratory Use. 2ª Edição. Oxford: Elsevier, 2009

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

MONTOVANELI, Giovanni Ferreira; BITTENCOURT, GUILHERME HENRIQUE; RODRIGUES, SILAS PESSINI. VALIDAÇÃO DA COMPOSIÇÃO DE VETOR DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNA RECOMBINANTE NA MICROALGA CHLAMYDOMONAS REINHARDTII.. In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/317229-VALIDACAO-DA-COMPOSICAO-DE-VETOR-DE-EXPRESSAO-DE-PROTEINA-RECOMBINANTE-NA-MICROALGA-CHLAMYDOMONAS-REINHARDTII. Acesso em: 15/05/2025