PRODUÇÃO RECOMBINANTE E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA PROTEÍNA PLPRO DE SARS-COV-2

Rafaela Marques Chagas; Larissa Esteves Carvalho Constant; Diego Allonso

Todos os Trabalhos

Trabalho

Título do Trabalho

PRODUÇÃO RECOMBINANTE E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA PROTEÍNA PLPRO DE SARS-COV-2

Autores

Rafaela Marques Chagas
Larissa Esteves Carvalho Constant
Diego Allonso

Modalidade

Resumo apresentação oral padrão

Área temática

Centro de Ciências da Saúde (CCS)/Biofísica

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/316654-producao-recombinante-e-caracterizacao-funcional-da-proteina-plpro-de-sars-cov-2

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

Protease viral, PLpro, Sars-Cov-2

Resumo

Os coronavírus (CoV) são uma grande família de vírus conhecidos por infectar inúmeras espécies de animais, incluindo aves e mamíferos. Quando no hospedeiro humano, esses vírus se caracterizam por desenvolver uma síndrome respiratória severa e aguda. O novo coronavírus, denominado SARS-CoV-2, foi detectado inicialmente em dezembro de 2019 em Wuhan, na China, e é causador da COVID-19, doença que já matou mais de 1,4 milhões de pessoas no mundo. O genoma de SARS-COV-2 apresenta homologia de 83% com o SARS-CoV (LU et al, 2020). Tanto o SARS-CoV como o SARS-CoV-2 dependem criticamente da atividade de proteases virais: a protease principal (Mpro, também chamada de 3CLpro) e a protease semelhante à papaína (PLpro) (HARCOURT et al, 2004). A PLpro é uma enzima coronavírus essencial que é necessária para o processamento de poliproteínas virais para gerar um complexo de replicase funcional e permitir a disseminação viral. Além disso, possui duas atividades proteoliticas importantes: a remoção da ubiquitina (Ub) e da proteína semelhante à ubiquitina ISG15 (gene 15 induzido por interferon) das proteínas celulares (LINDNER et al, 2007). Devido às atividades de desubiquitinação e desISGilação, a SARS-CoV-PLpro desempenha um papel significativo na resposta imune inata durante a infecção viral. Por essa razão, essa enzima é um importante alvo molecular no projeto de drogas antivirais SARS-CoV. Embora os coronavírus que emergiram nos últimos 20 anos sejam identificados como altamente patogênicos para a população humana, ainda não existe um tratamento antiviral eficaz. O objetivo desse projeto é expressar, purificar e caracterizar funcionalmente a protease viral PLpro de Sars-Cov-2 obtida em Escherichia coli, de modo a contribuir para a triagem de fármacos com potencial atividade antiviral que possam auxiliar no combate à Covid-19. O gene do domínio protease da PLpro (resíduos 4955 a 5911) foi obtido sinteticamente a partir de uma cepa brasileira de Sars-Cov-2 (Genbank: MT350282.1) e clonado em pET28a, a montante do gene codificante de seis resíduos de histidina. O plasmídeo recombinante pET-PLpro foi utilizado para transformar cepas da bactéria Escherichia coli BL21(DE3), BL21(DE3)codon Plus, BL21(DE3)pLysS e Rosetta (DE3). As células recombinantes foram submetidas a diferentes condições de cultivo a fim de obter o melhor protocolo de expressão da protease recombinante. Foram testados diferentes densidades óticas (OD600nm) de indução, diferentes concentrações do agente indutor IPTG (0,5 a 1 mM), temperaturas (18º, 25º e 37ºC) e tempo de indução (4h, 6h ou ON). A melhor expressão foi obtida pela cepa BL21(DE3) a 25ºC com indução com 1 mM de IPTG por 4h. Atualmente estamos expressando em larga escala para posterior purificação em coluna de afinidade Ni+2NTA. Uma vez tendo a protease purificada, realizaremos uma caracterização funcional com uma biblioteca combinatória de substratos previamente descritos na literatura. Referências bibliográficas HARCOURT, B. H. et al. Identification of severe acute respiratory syndrome coronavirus replicase products and characterization of papain-like protease activity. Journal of Virology, 2004. v. 78, n. 24, p. 13600-13612. LINDNER, H. A. et al. Selectivity in ISG15 and ubiquitin recognition by the SARS coronavirus papain-like protease. Arch Biochem Biophy, 2007. v. 466, n. 1, p. 8-14. LU, R. et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet, 2020. v. 395, n. 10224, p. 565-574.

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

CHAGAS, Rafaela Marques; CONSTANT, Larissa Esteves Carvalho; ALLONSO, Diego. PRODUÇÃO RECOMBINANTE E CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA PROTEÍNA PLPRO DE SARS-COV-2.. In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/316654-PRODUCAO-RECOMBINANTE-E-CARACTERIZACAO-FUNCIONAL-DA-PROTEINA-PLPRO-DE-SARS-COV-2. Acesso em: 06/08/2025