ESTUDO PARA O MELHORAMENTO DE UMA NOVA LIPASE DE USTILAGO HORDEI PARA EXPRESSÃO EM PICHIA PASTORIS

Luca Massaglia; Mônica Pires Gravina de Oliveira; Rafael Dias Mesquita; Gabriela Coelho Brêda; Rodrigo Volcan Almeida

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Trabalho

Título do Trabalho

ESTUDO PARA O MELHORAMENTO DE UMA NOVA LIPASE DE USTILAGO HORDEI PARA EXPRESSÃO EM PICHIA PASTORIS

Autores

Luca Massaglia
Mônica Pires Gravina de Oliveira
Rafael Dias Mesquita
Gabriela Coelho Brêda
Rodrigo Volcan Almeida

Modalidade

Resumo apresentação oral padrão

Área temática

Centro de Ciências Matemáticas e da Natureza (CCMN)/Bioquímica

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/315930-estudo-para-o-melhoramento-de-uma-nova-lipase-de-ustilago-hordei-para-expressao-em-pichia-pastoris

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

lipases, CalB, leveduras, biologia molecular

Resumo

Lipases são biocatalisadores capazes de realizar diversas reações em triglicerídeos e ligações éster, como hidrólise, esterificação e transesterificação. Na indústria, essa classe de enzimas possui grande importância, utilizada na formulação de produtos de limpeza, processamento de alimentos e síntese de fármacos, por exemplo. A lipase mais estudada e com maior uso comercial é a lipase B (CalB) de Candida antarctica, devido a sua boa estabilidade, compatibilidade com diversos substratos e alta enantioseletividade. Por isso, existe uma busca por lipases com propriedades similares e, entre elas, a lipase de Ustilago hordei é interessante por apresentar alta homologia com a CalB. O gene que codifica essa enzima, denominado UhL, foi clonado e expresso em Pichia pastoris através do vetor pPICZa. A expressão foi confirmada, entretanto a enzima apresentou menor estabilidade à temperatura que a LipB, enzima obtida da clonagem do gene de CalB em P. pastoris (Brêda, 2019). Buscando na literatura, foram encontrados relatos que modificações no C-terminal da sequência de lipases reduzem a estabilidade, enquanto modificações no N-terminal apresentam pouco efeito (Koch et al., 2014). Além disso, foi constatado que a inserção da cauda de polihistidina (his-tag), técnica comum para facilitar a purificação, no N-terminal aumentou a estabilidade de CalB (e Cunha et al., 2019). Como o gene UhL foi clonado e expresso com his-tag no C-terminal (Breda, 2019), o presente trabalho teve como objetivo modificar o gene a fim de remover o his-tag e inseri-lo no N-terminal e verificar o efeito na estabilidade. Para modificar a localização do his-tag, foi feita a extração do plasmídeo contendo o gene UhL, estocado em Escherichia coli. O plasmídeo foi utilizado como molde em reações de PCR, usando uma DNA polimerase de alta fidelidade (Phusion–Thermofisher). Foram usados dois pares de oligos para amplificação do gene sem his-tag (UhL_WO) e com his-tag N-terminal (UhL_NHis). Em seguida, foi feita a digestão dos produtos da amplificação e do vetor pGAPZa, utilizando as enzimas de restrição XhoI e XbaI seguindo protocolo do fornecedor (NEB). As amplificações e a digestão foram confirmadas através de eletroforese em gel de agarose com revelação por brometo de etídio e exposição à luz UV. Os fragmentos de DNA foram então submetidos a protocolos de purificação para posteriores reações de ligação e a construção será inserida no genoma de Pichia pastoris e expresso para analisar os efeitos das modificações realizadas. Além da modificação proposta, foi feita uma pesquisa bibliográfica buscando artigos sobre modificações na sequência da CalB para melhorar as suas propriedades. Até agora foram catalogados 35 artigos e resumidos os efeitos das mutações propostas. Ainda serão pesquisados mais trabalhos para obter uma boa base para propor outras modificações na UhL e melhorar a sua performance. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BRÊDA, G. C. A levedura Pichia pastoris como plataforma para a obtenção de dois produtos de interesse biotecnológico: o ácido 3-hidroxipropiônico e uma nova lipase de Ustilago hordei. 2019. 196 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, R. J., 2019 E CUNHA, D. A. B., BARTKEVIHI, L., ROBERT, J. M., CIPOLATTI, E. P., FERREIRA, A. T. S., OLIVEIRA, D. M. P., GOMES-NETO, F., ALMEIDA, R. V., FERNANDEZ-LAFUENTE, R., FREIRE, D. M. G., ANOBOM, C. D. Structural differences of commercial and recombinant lipase B from Candida antarctica: An important implication on enzymes thermostability. International Journal of Biological Macromolecules, 2019, 140, 761–770. KOCH, B., SCHMIDT, C., PLOIER, B., DAUM, G. Modifications of the C terminus Affect Functionality and Stability of Yeast Triacylglycerol Lipase Tgl3p. The Journal of Biological Chemistry, 2014, 289, 28, 19306 –19316.

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

MASSAGLIA, Luca et al.. ESTUDO PARA O MELHORAMENTO DE UMA NOVA LIPASE DE USTILAGO HORDEI PARA EXPRESSÃO EM PICHIA PASTORIS.. In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/315930-ESTUDO-PARA-O-MELHORAMENTO-DE-UMA-NOVA-LIPASE-DE-USTILAGO-HORDEI-PARA-EXPRESSAO-EM-PICHIA-PASTORIS. Acesso em: 28/06/2025