CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA ENZIMA GLICOSAMINA-6-FOSFATO SINTASE (GLMS) DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL COMO ALVO FARMACOLÓGICO PARA NOVOS ANTIBIÓTICOS

Victória Trindade Maller Carvalho; Caio Felipe de Araujo Ribas Cheohen; Manuela Leal da Silva; Diego Allonso

Título do Trabalho

Autores

Victória Trindade Maller Carvalho
Caio Felipe de Araujo Ribas Cheohen
Manuela Leal da Silva
Diego Allonso

Modalidade

Resumo apresentação oral padrão

Área temática

Centro de Ciências da Saúde (CCS)/Biotecnologia

Data de Publicação

22/03/2021

País da Publicação

Brasil

Idioma da Publicação

Português

Página do Trabalho

https://www.even3.com.br/anais/jgmictac/314818-caracterizacao-funcional-da-enzima-glicosamina-6-fosfato-sintase-(glms)-de-pseudomonas-aeruginosa-e-avaliacao-de-

ISBN

978-65-5941-128-3

Palavras-Chave

biotecnologia, biologia-molecular, bioquímica

Resumo

A Pseudomonas aeruginosa, bactéria Gram-negativa associada às infecções do trato respiratório e gastrointestinal, é tida como um nível de ameaça sério pelo CDC. Atualmente já se tem descrito cepas de P. aeruginosa resistentes a praticamente todos os antibióticos comerciais e estas compreendem cerca de 13% dos casos de infecção grave em hospitais, resultando em aproximadamente 400 óbitos anuais. Estudos multicêntricos desenvolvidos para acompanhar o aumento da resistência no Brasil apontam que 30% dos casos de infecção por esta espécie ocorrem por cepas multirresistentes (Neves et al., 2011). A enzima glicosamina-6-fosfato sintase (GlmS), que catalisa a primeira e etapa limitante da biossíntese das hexosaminas cujo produto final é um precursor de várias macromoléculas estruturais, como os peptideoglicanos e lipopolissacarídeos (Moraes et al.,2015), além de atuar na regulação de importantes vias metabólicas intracelulares, apresenta potencial promissor como alvo antimicrobiano, uma vez que a deleção do seu gene é letal para as bactérias. Somado a isso, a GlmS é um alvo ainda inexplorado para o desenvolvimento de novos antibióticos, constituindo um grande atrativo do ponto de vista de inovação. Neste contexto este projeto tem como objetivo a caracterização bioquímica, estrutural e funcional da enzima GlmS de P. aeruginosa. Para isso, o gene recombinante da GlmS foi sinteticamente produzido e clonado em plasmídeo para expressão em procariotos pET28a. Foi inserido o gene que codifica uma cauda de histidina (6xHisTag) no terminal 3’ do gene no plasmídeo recombinante pET-GlmS com intuito de facilitar posterior purificação em coluna de afinidade Ni+2NTA. A expressão da enzima ocorreu em células de Escherichia coli cepa BL21(DE3) em meio LB, a 37ºC com indução de 1mM de IPTG por 3h. Para a purificação, o clone foi submetido a expressão em larga escala (2L) e então submetido a uma cromatografia de afinidade. A confirmação da identidade da enzima purificada foi realizada por espectrometria de massas, estando de acordo com o esperado. Para a caracterização estrutural, serão realizados testes termodinâmicos para analisar a estabilidade das estruturas secundária, com auxílio da técnica de espectroscopia de dicroísmo circular, e terciária da enzima, a partir da técnica de espectroscopia de fluorescência, que serão realizados na presença e ausência dos substratos naturais da enzima: a glutamina e frutose-6-fosfato. A atividade completa (glutaminase e isomerase) é caracterizada pela formação de glicosamina-6-fosfato (GlcN6P), e será determinada por ensaio colorimétrico de Elson-Morgan (Elson et al., 1933). A concentração de GlcN-6P será determinada comparando a absorbância das amostras com curva padrão processada da mesma maneira. A avaliação do potencial da GlmS como alvo relevante para o desenvolvimento de novos antibióticos é promissora, visto que infecções bacterianas multirresistentes são um fenômeno que vem crescendo alarmantemente a cada dia. Referências bibliográficas: Neves, P. R., Mamizuka, E. M., Levy, C. E. & Lincopan, N. Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa: An endemic problem in Brazil. J. Bras. Patol. e Med. Lab.,2011, v. 47, n. 4, p. 409-420. Moraes, Gleiciane Leal; Gomes, Guelber Cardoso; Monteiro de Sousa, Paulo Robson; Alves, Cláudio Nahum; Govender, Thavendran; Kruger, Hendrik G.; Maguire, Glenn E.M.; Lamichhane, Gyanu; Lameira, Jerônimo. Structural and functional features of enzymes of Mycobacterium tuberculosis peptidoglycan biosynthesis as targets for drug development. Tuberculosis, 2015, 95(2), 95–111. Elson, L. A., and Morgan, W. T. A colorimetric method for the determination of glucosamine and chondrosamine. Biochem J, 1933, 27, 1824-1828.

Título do Evento: XLII Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural (JICTAC 2020 - Edição Especial) - Evento UFRJ
Título dos Anais do Evento: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural
Nome da Editora: Even3
Meio de Divulgação: Meio Digital

Como citar

CARVALHO, Victória Trindade Maller et al.. CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DA ENZIMA GLICOSAMINA-6-FOSFATO SINTASE (GLMS) DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL COMO ALVO FARMACOLÓGICO PARA NOVOS ANTIBIÓTICOS.. In: Anais da Jornada Giulio Massarani de Iniciação Científica, Tecnológica, Artística e Cultural. Anais...Rio de Janeiro(RJ) UFRJ, 2021. Disponível em: https//www.even3.com.br/anais/jgmictac/314818-CARACTERIZACAO-FUNCIONAL-DA-ENZIMA-GLICOSAMINA-6-FOSFATO-SINTASE-(GLMS)-DE-PSEUDOMONAS-AERUGINOSA-E-AVALIACAO-DE-. Acesso em: 23/05/2025